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生物學評價

體外細胞毒性實驗

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MTT法:

1、將配制好的1×105/mL細胞懸液接種于96孔板,設空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組,每組各設至少6孔,每孔接種100uL細胞懸液,置CO2培養箱(含體積分數5%二氧化碳氣體)37℃培養24h。

2、 培養24h后棄去原培養液,空白對照組加入新鮮細胞培養液,陰性對照組加入陰性對照品浸提液,陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液,供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液(100%、75%、50%、25%),置CO2培養箱繼續培養24h。

3、 更換培養液24h后,置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入50uL質量濃度為1mg/mL的MTT溶液,繼續培養2h后棄去孔內液體,加入100uL異丙醇,置振蕩器上振蕩,在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度,計算相對增殖率(RGR)。

直接接觸法:

1、 將已培養 48h~72h 生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數,將細胞懸液配制成密度 1.0×105/mL,接種于直徑 35mm 培養皿,每皿 2mL,共 9 皿。置 CO2培養箱 (5%CO2,37℃,>90%濕度)培養至近匯合單層細胞形成。 

2、 棄去原培養液。加入 2mL 新鮮培養基,在培養皿中央部位的細胞層上輕輕放置一片供試樣品,共 3 皿。 同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續培養 24h。 

3、 培養結束后,于顯微鏡下觀察細胞形態、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據以下標準判斷試驗樣品分級,分級大于 2 級時被認為有細胞毒性作用。

瓊脂擴散法:

1、將已培養48h~72h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數,將細胞懸液配制成密度1.0×105/mL,接種于直徑35mm培養皿,每皿2mL,共9皿。置CO2培養箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)培養至近匯合單層細胞形成。

2、棄去器皿中的培養基,將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養基混合,使瓊脂最終質量濃度為0.5%~2%,并吸取適宜體積加入至每只培養皿內。細胞培養只能使用適合于哺乳動物細胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養基的混合物宜為液態,并且溫度適合于哺乳動物細胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養箱孵育30min,孵育后丟棄多余的中性紅液,將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一,共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續培養24h。 

3、培養結束后,將培養皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下,于顯微鏡下觀察培養皿中細胞形態、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據表1判斷試驗樣品分級,分級大于2級時被認為有細胞毒性作用。

檢測標準:

醫療器械生物學評價 第5部分:體外細胞毒性試驗GB/T 16886.5-2017
醫療器械生物學評價 第5部分:體外細胞毒性試驗ISO 10993-5:2009
醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分:生物學試驗方法GB/T 14233.2-2005 8
醫用有機硅材料生物學評價試驗方法GB/T 16175-2008 5


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